Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК

Наличие у ДНК таких свойств, как возможность разделения полинуклеотидных цепей и принцип комплементарного соединения азотистых оснований, предполагает, что каждая отдельная цепь ДНК может служить матрицей для построения второй комплементарной цепи, т. е. информация, необходимая для воспроизведения последовательности оснований в ДНК, заложена в структуре ее двойной спирали.

Полуконсервативный синтез представляет собой сложный ферментативный процесс.

Основным ферментом, ответственным за синтез новой цепи, является ДНК-полимераза. Данный фермент обладает свойством удлинять цепь ДНК, последовательно присоединяя по одному нуклеотиду к З’-концу, осуществляя синтез в направлении 5-3′.

ДНК-полимераза самостоятельно не может инициировать синтез на одноцепочечной ДНК; для этого необходим небольшой участок двухцепочечной ДНК. Чтобы его создать и инициировать синтез, к матричной ДНК добавляют короткий фрагмент одноцепочечной ДНК (около 20 п.н.), называемый ДНК-затравкой или праймером. Нуклеотидная последовательность ДНК-затравки должна быть комплементарна определенному участку матричной ДНК.

Предшественниками синтеза ДНК и источником энергии для реакции являются нуклеозидтрифосфаты (dNTP), которые в процессе этой реакции утрачивают две конечные фосфатные группы. Выбор нуклеотида, добавляемого к цепи, определяется комплементарностью оснований. На основе полуконсервативного синтеза ДНК в 1985 г. Мюллисом был открыт универсальный метод синтеза заданной последовательности ДНК, названный методом полимеразной цепной реакции (ПЦР – Polymerase chaiN reaction, PCR).

ПЦР представляет собой циклический процесс, осуществляемый при участии ДНК-полимеразы и обеспечивающий амплификацию (копирование) имеющейся последовательности ДНК. В процессе реакции данная последовательность накапливается экспоненциально, и к концу реакции ее количество измеряется миллионами копий.

Границы амплифицируемого участка ДНК определяются двумя праймерами, комплементарными З’-концам интересующей последовательности. Цикл амплификации состоит из трех фаз: денатурации, отжига и достраивания, различающихся температурой. В первой фазе под действием высокой температуры (около 94-95 °С) происходит денатурация ДНК с образованием одноцепочечных молекул.

При более низкой температуре может происходить ренатурация исходной матричной ДНК и появление неспецифических продуктов реакции. В период третьей фазы с участием ДНК-полимеразы происходит синтез или достраивание цепи, комплементарной матричной. Температура обычно варьирует в диапазоне 70-75 °С.

Теоретически, к концу 30-го цикла амплификации на основе одной молекулы ДНК синтезируется 109 копий интересующей последовательности.