Исследование локусов ДНК, обладающих полиморфизмом длины

Применяемая в настоящее время технология исследования локусов, обладающих полиморфизмом длины (STR-локусы), является наиболее распространенной в практике криминалистического ДНК-анализа. Это связано с ее относительной простотой, а также возможностью автоматизировать многие этапы исследования.

При этом синтезируются фрагменты ДНК, длина которых зависит от числа повторяющихся единиц в локусе тандемных повторов. В случае исследования гомозиготного образца образуется один вид фрагментов, а в случае гетерозиготного – два.

На следующем этапе исследования продукты ПЦР подвергают электрофорезу, в результате чего получают аллельный профиль исследуемого образца ДНК. Для установления аллелей на соседнюю дорожку геля помещают лэддер, или аллельный маркер, который содержит фрагменты ДНК, соответствующие по размерам всем встречающимся аллелям исследуемого локуса. Аллельный лэддер обычно производится изготовителем реактивов для амплификации.

В случае исследования гетерозиготных образцов ДНК (содержащих смесь двух различных последовательностей) перед этапом секвенирования ДНК последовательности каждого аллеля должны быть выделены из смеси. Данную процедуру бывает нелегко выполнить, поэтому в криминалистическом ДНК-анализе локусы ядерной ДНК этим методом не исследуют.

Метод секвенирования обычно применяют для исследования полиморфных участков митохондриальной ДНК, которая присутствует в клетках одного человека в виде единственного типа последовательности.

На первом этапе исследования проводят амплификацию полиморфного участка анализируемого образца ДНК методом полимеразной цепной реакции. После этого продукты ПЦР денатурируют и проводят четыре варианта реакции синтеза второй цепи ДНК, используя одноцепочечную ДНК в качестве матрицы.

На заключительном этапе секвенирования продукты синтеза подвергают электрофорезу, помещая их на четыре соседние дорожки одного геля. Полосы, соответствующие фрагментам определенного размера, появляются только на одной из четырех дорожек. Это позволяет определить нуклеотид, находящийся в данном положении цепи ДНК.

Результаты секвенирования впоследствии объединяют, и выявляют все участки, в которых не наблюдается комплементации и где возможны ошибки. Нуклеотидную последовательность этих участков уточняют с помощью дополнительных исследований.