I этап. Выделение ДНК осуществляют различными методами. Один из наиболее современных и эффективных является сорбционный метод выделения ДНК на основе кремниевых или магнитных частиц. Этот метод обеспечивает более высокий выход, концентрацию и чистоту выделяемой ДНК за наименьший период времени, а также безопасность использования его для персонала лаборатории.
Также возможно использование бумажных фильтров FTA (карта FTA), которые содержат химические вещества для лизирования образцов и последующего связывания высвобожденной нуклеиновой кислоты. Белки, высвобождаемые в процессе лизиса, денатурируются и связанные нуклеиновые кислоты защищены от разрушающего воздействия нуклеаз, окисления и ультрафиолетового излучения.
II этап. Постановка реакции амплификации. Данный этап проводят путем двух последовательных реакций ПЦР – в режиме реального времени и основной реакции. Для измерения концентрации и оценки качества полученного препарата ДНК проводится реакция ПЦР системой ПЦР-анализа в реальном времени (реал-тайм ПЦР).
Использование данной системы позволяет установить концентрацию ДНК в количестве тысячных долей нанограмма, отличить ДНК человека и высших приматов от ДНК животных и бактериальной микрофлоры. Кроме того, метод выявляет наличие в препаратах ДНК веществ, тормозящих реакцию ПЦР, так называемых ингибиторов ПЦР (гематин, билирубин, меланин, гуминовые кислоты, масло, красители), что в дальнейшем корректируется правильно выбранной экспертной тактикой.
Современные наборы реактивов для реал-тайм ПЦР также определяют концентрацию общей и мужской ДНК в препарате, что необходимо для изучения смешанных биологических следов от двух и более лиц, особенно при расследовании уголовных дел об изнасилованиях. Также с помощью данного метода можно оценить степень деградации ДНК в препаратах.
Таким образом, результаты реал-тайм ПЦР предопределяют качество последующей основной реак-ции энзиматической амплификации. В основной реакции ПЦР используются высокоспецифичные диагностические тест-системы, которые разрабатываются по единому принципу подбора праймеров на известной последовательности нуклеотидов ДНК и оптимизации условий энзиматической амплификации выбранных генетических локусов.
III этап. На конечном этапе полученные амплификационные продукты фракционируют с помощью метода ручного или автоматического электрофореза в полиакриламидном геле, используя различные методы детекции. В настоящее время, преимущественно используется регистрация амплифицированных фрагментов ДНК с использованием наиболее чувствительных методов детекции, например, с помощью флуоресцентных меток, возбуждаемых лазерным излучением.
Данный метод осуществляется с помощью генетического анализатора (секвенатора), в котором осуществляется автоматический анализ электрофоретического разделения молекул ДНК с очень высокой точностью и скоростью. Модели генетических анализаторов постоянно совершенствуются, позволяя исследовать одновременно до 32 препаратов ДНК.
IV этап. Вероятностно-статистический анализ полученных результатов обязателен для оценки полученных результатов судом. Существуют законодательно определенные величины вероятности родства, по достижении которых генетическое исследование может быть окончено.
